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納百恩公司建議在納豆行業中推廣:納豆激酶活性(NKIU)測定方法

納百恩公司建議在納豆行業中推廣:納豆激酶活性(NKIU)測定方法

作者:
張迎慶
來源:
原創
2019/01/07 23:26
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評論:
【摘要】:
在國內較為適宜的方法是采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法,并以可官方獲取的尿激酶為標準品的來測定納豆激酶的活性,該法可以通過在體外模擬人工血栓平板上產生的透明圈直觀定量測定溶栓效果,方法便捷可靠,單位命名為NKIU(NK是納豆激酶英文縮寫)。為此,特在納豆行業中推廣。

納豆激酶活性測定的方法有多種多樣,原理也各不相同。主要有纖維蛋白平板法、纖維蛋白塊溶解時間法、四肽底物法、血清板法、酶聯免疫吸附法及紫外分光光度法。其中纖維蛋白塊溶解時間法不夠精確,一般用于粗酶的活性測定;四肽底物法不完全符合人體的血栓環境,測得的結果與實際有些差異;血清板法對人工血栓的制作要求較高;酶聯免疫吸附法價格較貴;在日本采用較多的是紫外法,采用FU為單位,但由于必須采用日本官方健康營養食品協會的標準品進行校正,而標準品官方不對外提供,因此無法在國內用FU計量。且一些保健食品中的其他組分也可能因在該測定吸收波長處產生干擾,影響其準確性,這些因素限制了該方法的推廣使用。因此,在國內較為適宜的方法是采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法,并以可官方獲取的尿激酶為標準品的來測定納豆激酶的活性,該法可以通過在體外模擬人工血栓平板上產生的透明圈直觀定量測定溶栓效果,方法便捷可靠,單位定為NKIU(NK是納豆激酶英文縮寫)。為此,特在納豆行業中推廣。

 

 

瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定納豆激酶溶栓活力方法

 

瓊脂糖-纖維蛋白平板法是目前最常用的纖溶酶溶栓活力的測定方法,也是最早用于納豆激酶溶栓活力的測定方法之一。瓊脂糖-纖維蛋白平板法的原理是用瓊脂糖作為固體支持,以凝血酶和纖維蛋白原作用后制成人工血栓平板,取納豆激酶樣品點于平板上,恒溫孵育一段時間后,用溶解圈垂直直徑的乘積來表示溶栓活力。本方法以尿激酶(Urokinase,UK)作為對照標準品,納豆激酶(Nattokinase,NK)的活性單位換算成相當于標準品的單位數(定義為NKIU)。

一、試劑與儀器

1.1試劑

牛凝血酶(190BP/支), 牛纖維蛋白原(98mg可凝蛋白/支),尿激酶(1280IU/支),瓊脂糖,硼酸,硼砂(四硼酸鈉)

1.2儀器設備

高速離心機,全自動生化培養箱

1.3工作溶液配制

(1)50mM硼砂緩沖溶液(pH7.8,含150mMNaCl)

取0.05M硼砂20mL,0.2M硼酸80mL,加NaCl 0.8766 g,混合后制得。

(2)牛凝血酶(1BP/mL)

1支牛凝血酶(190BP/支)加入1.9mL硼砂緩沖溶液(pH7.8,含150mMNaCl)溶解得100BP/mL,取10uL稀釋至1mL,得1BP/mL。

(3)纖維蛋白原溶液

1支纖維蛋白原(98mg可凝蛋白/支)加3.27mL硼砂緩沖溶液(pH7.8,含150mMNaCl)溶解得30mg/mL,取0.5mL稀釋至10 mL,得1.5mg/mL纖維蛋白原溶液備用。

(4)1.5%瓊脂糖

1.5 g瓊脂糖加入100mL生理鹽水,微波加熱溶解,55℃備用。

(5)尿激酶標準溶液

取1支尿激酶(1280 IU/支)加生理鹽水配制得到19.2 IU/mL, 38.4 IU/mL, 57.6 IU/mL, 76.8 IU/mL, 96.0 IU/mL尿激酶溶液。

 

二、實驗方法

2.1樣品處理方法

取供試品6粒,剪破內容物和外殼一并放入燒杯,加入10mL生理鹽水浸提(4℃,4h),5000 rpm離心20min,取上清備用。

2.2 瓊脂糖-纖維蛋白平板制備方法

55℃保溫平衡的1.5%瓊脂糖40mL,加入纖維蛋白原(1.5 mg/mL)40mL,以及凝血酶(1BP/mL)4mL,迅速倒入平板中,4℃冷卻30min,備用。

2.3加樣、培養、計算方法

空心毛細管在平皿上打孔,直徑為2 mm。在孔內分別加供試品溶液和標準品溶液,精密量取不同濃度的尿激酶標準品溶液及供試品溶液各10mL,分別點在同一平皿中,加蓋,置37℃恒溫箱中反應18h。取出后用卡尺測量溶圈垂直兩直徑,以尿激酶標準品單位數的對數為橫坐標,垂直兩直徑乘積的對數為縱坐標,計算回歸方程,將供試品垂直兩直徑乘積的對數代入回歸方程,計算供試品效價單位數。標準品各做兩點,供試品做三個點,以平均值計算。通過回歸方程,根據供試樣品量及定容體積, 計算樣品中納豆激酶活力。

供試品溶栓活力(NKIU尿激酶/粒)=供試品效價(IU/mL)×定容體積(mL)/粒數

 

張迎慶簡介

張迎慶(1969-),女,博士,教授,湖北工業大學生物工程與食品學院副院長。

湖北省藥學會生化制藥專業委員會委員。2005年入選湖北省新世紀高層次人才工程(第三層次)。2001-2002年赴波蘭雅蓋隆大學醫學院留學進修天然藥物。獲湖北省科技進步二等獎1項(第3完成人);湖北省科技進步三等獎1項(第5完成人);湖北省優秀教學成果三等獎1項(第1名);主持完成省級科研項目3項,其中1項鑒定為國際先進水平;參與完成國家級及省級項目12項;主持橫向科研8項,公開發表論文SCI等三大檢索收錄論文10余篇。獲授權國家發明專利2項。

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